细胞冻存是将细胞置于低温环境中，以降低细胞代谢，达到长期储存和保种的目的，从而在后续实验或临床使用中能够保持细胞活性。细胞冻存通常遵循慢冻原则，这种方法可以使细胞逐步脱水，避免因大冰晶的形成而造成细胞损伤。

一、原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动和酶活性几乎全部停止，而低于-130℃时，细胞能够达到最佳存活率。液氮是实现细胞长期保存的理想选择。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够迅速穿透细胞膜，降低冰点并缓慢冷冻，同时提高细胞膜的通透性和细胞内离子浓度，减少冰晶形成，从而有效保护细胞。

二、贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液；
2. 用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（此步骤同细胞传代操作）；
3. 消化终止后，重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5分钟；
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，最佳冻存密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，一般不低于5×10⁵/ml；
5. 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
6. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜；
7. 最后，将冻存管转移至液氮中长期保存。

三、悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液吹吸均匀，并移入离心管；
2. 1000rpm离心3分钟，以收集细胞沉淀；
3. 用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10⁶/ml，一般不低于5×10⁵/ml；
4. 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
5. 将分装好的冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜；
6. 最后，将冻存管转移至液氮中长期保存。

注意事项

① 细胞培养、传代以及冻存过程中必须严格遵循无菌操作规范。
② 传代时需适度消化，消化的时间与消化液种类、配制时间及加入量等因素密切相关。应观察细胞形态变化，若出现细胞质回缩、连接变松散或有浮起现象，应立即终止消化。
③ 传代应在细胞处于对数期而未达到汇合状态时进行。
④ 细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中。
⑤ 选择汇合度在80%-90%左右且活力达到90%以上的对数生长期细胞进行冻存，以确保最佳状态，冻存密度可根据细胞特性进行调整。
⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液及完全培养基等试剂需复温至室温备用。
⑦ 冻存前注意不得消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或时间过长，以免造成细胞损伤。
⑧ 冻存管盖子须拧紧，避免复苏时水浸入导致污染。
⑨ 细胞不应长期保存在-80℃冰箱中，放置时间应不超过3天。
⑩ 液氮或冰箱相对较远时，细胞需在干冰或冰盒上运输至细胞房。

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